对清醒行为小鼠进行神经元钙成像需要使用微型荧光显微镜，并涉及一系列操作流程。首先通过手术暴露目标细胞群并植入显微镜组件。小鼠经过恢复期后，接受训练以表现出特定行为。最后，神经元活动被成像并与行为同步记录。为充分发挥该技术优势，需谨慎选择钙指示剂并精心设计实验。本文阐述了获取高质量钙成像数据的关键步骤与注意事项，并以Thy1.GCaMP6f转基因小鼠在直线跑道上奔跑时的海马位置细胞活动成像为例进行说明。
一、介绍
微型显微镜钙成像技术能够在自由行为小鼠中，对大范围神经元群体进行延时、细胞类型特异性的神经元活动记录。在本文中，我们将阐述如何利用微型显微镜记录神经元活动，以研究行为期间空间信息处理的神经相关性。引发空间信息处理的最简单行为之一是在一维线性轨道上来回奔跑。当小鼠在直线跑道上奔跑时，空间信息由背侧海马中的位置细胞进行处理。位置细胞是锥体神经元，其编码小鼠在线性轨道上所占据的位置。位置细胞的感受野，即位置野，是其活动增强的区域。位置野随时间保持稳定，因此提供了由此形成的认知地图和记忆。能够记录小鼠在空间环境中移动时的神经元活动，使得微型显微镜成为研究位置细胞的理想工具。为获取位置细胞记录，我们将描述导管植入、镜头安装、直线跑道奔跑行为训练，以及钙成像记录和相应行为数据收集的流程。我们重点介绍在转基因小鼠直线跑道奔跑期间，于海马CA1区记录到的位置细胞活动。然而，此处描述的技术可轻松调整并应用于各种环境和行为，或与病毒表达的钙指示剂结合使用。
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有几个实验设计决策需要考虑，例如选择被试内设计还是被试间设计。微型显微镜的优势之一在于可以在数周至数月内对同一被试进行多次成像。被试内比较可以最大化统计效力，并研究位置细胞随时间的稳定性。然而，需要考虑实验时间推移带来的影响，例如习得行为的改善和位置细胞活动随时间的变化。
钙指示剂的选择也很重要。GCaMP6传感器目前分为三类：慢速、中速和快速。慢速传感器（GCaMP6s）在活跃时显示出更大的荧光强度变化，但衰减时间常数长；快速传感器（GCaMP6f）信噪比较小，但动力学更快，从而能提高神经元活动的时间分辨率。传感器递送方式的选择取决于实验因素，例如要成像的神经元类型和位置。病毒表达的钙传感器可通过滴定获得高表达水平，从而产生强信噪比。此外，使用细胞类型特异性启动子和立体定位注射可实现钙传感器在明确神经亚群中的表达。病毒注射钙传感器的缺点在于增加了额外的手术步骤，且传感器表达水平会随时间变化。当比较同一动物间隔数周的钙成像数据时，这种变化可能成为潜在的混杂因素。转基因表达钙传感器的小鼠具有传感器表达水平随时间稳定的优势；然而，据报道，某些品系的这类小鼠表现出异常的神经元活动。
市场上有多种可用的转基因小鼠品系和病毒，各自针对不同的细胞群体和脑区进行了优化。关于病毒注射步骤的方案，可参阅相关文献。最后，进行钙成像实验需要充足的计算基础设施。记录的图像需要大量的存储空间（原始钙成像数据通常每分钟约1 GB）和处理能力。此外，大多数市售图像处理软件包可将原始成像数据处理到能够识别单个神经元及其相应钙瞬变的程度；然而，任何更高级的分析，例如位置细胞的识别或对其特性的深入表征，都需要使用软件中的自定义程序来完成。
注意： 所有涉及活体动物的程序必须首先获得机构动物护理与使用委员会的审查和批准，并且必须遵循官方批准的实验动物护理和使用程序。注意： 在这些程序中使用无菌外科技术非常重要。
导管植入
本方案适用于内源性表达钙传感器的转基因小鼠，也适用于通过病毒表达钙指示剂的小鼠。本文将以表达Thy1.GCaMP6f的转基因小鼠模型为例进行说明。Thy1.GCaMP6f小鼠的传感器表达水平随时间保持稳定，这对于位置细胞或其他长期记录研究是有利的。为了使用微型显微镜记录海马位置细胞，首先需要在麻醉下对小鼠进行手术。该手术的目的是移除皮层和胼胝体组织，以获取对海马CA1区位置细胞的光学通路，并植入引导导管。
简而言之，手术持续60至90分钟，期间使用环钻移除海马上方的一块圆形颅骨。仔细抽吸去除上覆的皮层及外囊浅层。使用无菌林格氏溶液多次冲洗以清除多余血液后，将一个底部固定有盖玻片的引导导管植入并固定在背侧海马上方，以永久获取对下层细胞的光学通路。
图1. 导管和基板植入示意图。（A）导管植入手术示意图。仅移除安装并用牙科水泥固定导管所需的头皮范围。眼睛周围保留足够组织以维持小鼠眨眼能力。靠近耳朵和颈部区域也保留充足组织。水泥帽与切口周围组织之间预留约1毫米间隙，确保牙科水泥干燥，以实现最大植入稳定性。切口部位周围的组织会逐渐自行闭合。（B）安装的微型显微镜及其下方镜头和导管的示意图。（C）成功安装基板并搭载微型显微镜的示意图。小鼠从导管植入手术恢复2周后，在正确的焦平面安装基板并用牙科水泥密封。
材料
林格氏溶液成年C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6f)GP5.17Dkim/J小鼠，20至30克异氟烷脱毛膏丁丙诺啡眼科软膏碘伏70%乙醇2% (w/v) 熔化的琼脂糖C&B Metabond用不透射线L-粉末C&B Metabond用"B"快速基质"C"通用TBB催化剂牙科丙烯酸树脂硅酮密封剂27-G、30-G钝头针5毫升注射器真空管路和液体收集瓶电子天平小动物异氟烷麻醉系统立体定位仪用小鼠麻醉面罩适配器电动剃毛器小动物立体定位仪带25毫米可倾斜立柱的双臂悬臂支架，用于安装体视显微镜无菌棉签手术铺巾杜蒙氏镊子2号和5号解剖剪手术刀柄及10号或15c刀片光学变焦体视显微镜1.8毫米环钻钻头带手柄的电动旋转钻1.8毫米外径玻璃底导管眼部棉签牙科丙烯酸混合系统LED光固化灯带探针的恒温毯系统
东莞市富临塑胶原料有限公司是 Inscopix 中国经销商，为中国客户提供Inscopix（双色成像、显微成像、双光子成像）产品。
准备手术设置
根据制造商说明对手术器械进行高压灭菌。 准备数根30-G钝头针，将针尖弯成90°角。 这将有助于触及将位于脑组织深处的抽吸部位。* 将装有林格氏溶液的5毫升注射器连接30-G钝头冲洗针，用于抽吸过程中冲洗脑组织。 将30-G钝头抽吸针连接到真空管路上用于抽吸。 抽吸物应用含10%漂白剂的液体收集瓶收集。麻醉并准备小鼠
称量小鼠体重。 将小鼠置于诱导室中，使用5%异氟烷（以氧气输送）麻醉，直至小鼠对脚趾和尾巴夹捏无反应（1至2分钟）。 用电推剪剃除小鼠头部毛发。 此步骤应注意避免剪掉胡须。* 将小鼠放入立体定位仪，将其鼻子放入麻醉面罩适配器中，并将异氟烷浓度降低至1.5%至2.5%，流速为0.5升/分钟。通过监测对脚趾夹捏的反应来验证麻醉深度是否充足。插入并拧紧耳杆，使小鼠头部稳定，在对颅骨施加适度向下压力时不会移动。 使用脱毛膏去除剩余毛发。用浸有林格氏溶液的棉签反复擦拭清洁头皮。 皮下注射0.05毫克/千克丁丙诺啡。 涂抹眼科软膏。 用一小块手术铺巾覆盖每只眼睛，以保护眼睛免受固化紫外线的照射。 确保舌头未阻塞呼吸。 皮下注射0.5毫升林格氏溶液以防止脱水。 用碘伏和70%乙醇交替擦洗头皮三次，进行消毒。准备开颅手术区域
用镊子夹起头皮，向上提起皮肤。然后用剪刀做侧向切口，移除一部分头皮（直径略小于1厘米）。移除组织应保守，仅移除安装显微镜部件所需的皮肤量。不要移除靠近眼睛的皮肤。 用手术刀片刮擦颅骨，彻底清除骨膜。 使用无菌棉签擦干并清洁颅骨。 在显微镜下，测量人字缝和前囟的坐标。为确保颅骨充分水平，这两个坐标在背腹轴上的差值应在约100微米以内。如有必要，调整立体定位仪以抬高或降低小鼠鼻子，并重复测量直至颅骨水平。 用手术刀片轻轻划擦颅骨表面，以增强骨水泥与颅骨的粘附能力。 根据以下立体定位坐标标记开颅中心点：前囟后2.3毫米，中线旁开1.89毫米。执行开颅手术
将1.8毫米环钻插入钻头手柄，并将手柄安装到立体定位仪臂上。将定位臂调整至与垂直方向成13°角，并移动定位臂使环钻与颅骨平行且正好位于标记的开颅位置上方。 启动钻头，同时使用立体定位仪操纵器非常小心地将环钻推入颅骨。持续操作直至完全钻穿颅骨。有时轻微钻入脑组织有助于切开硬脑膜。 抬起钻头，如果圆形颅骨碎片仍留在开颅窗内，用精细镊子小心取出。同时移除任何残留的硬脑膜。 在手术显微镜下，使用准备好的弯成70°至90°的钝头针进行抽吸步骤，将钝头针连接到带液体收集瓶的抽吸管路上，轻柔地移除开颅窗下方的脑组织以暴露海马CA1区： a. 使用非惯用手持续用林格氏溶液冲洗暴露的脑组织，防止组织长时间（大于2至3秒）暴露在空气中。使用惯用手持27-G钝头抽吸针，通过使抽吸针头沿开颅窗边缘做圆周运动，缓慢抽吸皮层组织。这是避免意外损伤组织的良好做法。开颅窗内会发生出血，这属正常现象。增加冲洗流量以保持视野清晰。 b. 当接近最终成像平面时，换用30-G抽吸针头，并观察到达外囊的视觉线索。将出现白色珍珠样光滑纤维，其质地明显比皮层组织更坚韧。通过抽吸暴露组织中的血液，仔细观察视觉迹象。此步骤出血也可能减少。 c. 在穿过外囊（白质的横向条纹）后停止。到达海马槽（白质的隔颞条纹）后，用抽吸针头小心剥离外囊的纤维。与此前移除的外囊纤维相比，此时的条纹看起来更精细、纹理更细。当到达海马包膜时，出血应极轻微，白质条纹应清晰可见。 d. 通过交替进行林格氏溶液抽吸和冲洗的步骤，确保出血已停止。为此，交替添加林格氏溶液，并小心抽吸，同时避免触碰开颅窗底部，因为触碰纤维会导致出血重新开始。使用冷溶液冲洗有助于抑制出血。植入导管
将导管的玻璃底端浸入林格氏溶液，以防止下方形成气泡，并用林格氏溶液填充包膜上方的区域。将导管放入开颅窗，使底部盖玻片置于液面之上。使用显微镜确保通过盖玻片看不到任何气泡。确保导管底座大致与颅骨齐平。在环钻仍连接于立体定位仪臂的情况下，将导管推入开颅窗：a. 将立体定位仪臂的角度从13°调整至8°。b. 降低环钻，使其齿槽置于暴露的导管顶部。c. 缓慢推进环钻，将导管推至腹侧深度1.09毫米。d. 撤回环钻，检查导管盖玻片下是否有气泡。 在植入的导管周围涂抹一圈温热的熔融2%琼脂糖，以在导管被粘固到位前稳定其位置。琼脂糖屏障还可防止胶水进入脑组织。 使用眼部棉签擦干手术区域，小心不要触碰导管。 配制骨水泥混合物：在一个小碟中，混合2小勺不透射线L-粉末、3滴"B"快速基质和1滴"C"通用TBB催化剂。 在暴露的颅骨表面及暴露的导管底座周围涂抹一层骨水泥混合物。 在骨水泥混合物层上覆盖牙科丙烯酸树脂，并在导管周围涂抹粘合剂。 用蓝色LED灯固化水泥，使导管完全粘附在颅骨上。 重复涂抹牙科丙烯酸树脂和固化的步骤，在导管周围构建一个水泥基座以提供进一步支撑。 使用一滴硅酮密封剂密封导管开口，防止灰尘进入。 皮下注射另外0.5毫升林格氏溶液和适当的镇痛剂。 关闭麻醉，将小鼠从立体定位仪上取下。 称量小鼠体重并将其放置在预热的加热垫上，使其从麻醉中完全恢复。 在接下来的48小时内观察小鼠是否有任何不良健康影响。光学镜头和基板安装
此程序的目的是完成小鼠身上硬件的安装，以便在海马体中进行细胞钙成像。首先目视检查导管下方的组织，确保其愈合良好且无前期手术残留的血液。然后将梯度折射率镜头插入并固定在已植入的引导导管内。镜头插入后，安装微型显微镜的基板，并在镜头组件周围用水泥固定。此程序完成后，可通过在基板上安装和拆卸微型显微镜，对小鼠进行重复成像。
材料已植入导管的小鼠异氟烷眼科软膏70%乙醇牙科丙烯酸树脂微型荧光显微镜（Inscopix）小动物立体定位仪微型显微镜基板小动物异氟烷麻醉系统立体定位仪用小鼠麻醉面罩适配器手术铺巾直径1.0毫米、长度4.0毫米的GRIN镜头压缩空气罐镜头清洁纸光学变焦体视显微镜真空抽吸器导管套管精细镊安装有采集软件的计算机光学胶18-G针头紫外固化灯牙科丙烯酸混合系统LED固化灯带探针的恒温毯系统
准备显微镜
将微型显微镜支架安装到立体定位仪臂上。 将基板安装到微型显微镜上。 将微型显微镜的聚焦转盘旋转至中心位置。植入GRIN镜头4. 称量已植入导管的小鼠体重。5. 将小鼠置于诱导室中，使用5%异氟烷（以氧气输送）麻醉，直至小鼠对脚趾和尾巴夹捏无反应。将动物固定在立体定位仪上，并将异氟烷浓度降低并维持在1.5%至2.5%。6. 涂抹眼科软膏，并在每只眼睛上覆盖一小块手术铺巾。7. 移除导管上的硅酮密封剂。8. 检查GRIN镜头是否有灰尘或碎屑，特别注意顶部和底部成像表面。如有必要，用压缩空气轻柔吹除灰尘。使用蘸有70%乙醇的镜头纸溶解空气无法清除的碎屑。9. 在手术显微镜下，目视检查引导导管下的组织，确认组织无血液和感染迹象。如有必要，通过用水冲洗并用真空抽吸去除的方式，清洁导管底部盖玻片上的任何碎屑。注意不要用抽吸针刮伤玻璃。10. 将镜头套管插入导管，直至其触底部的盖玻片。不要施加过大压力。11. 用精细镊子从侧面夹起GRIN镜头，轻轻将其插入金属套管内。使用镜头纸的一角轻轻向下推镜头，直至其与底部盖玻片齐平。12. 推进立体定位仪臂，降低微型显微镜使其靠近镜头。在GRIN镜头表面与显微镜镜头之间留出1至2毫米间隙。目视确保显微镜镜头和GRIN镜头的表面平行。如果不平行，稍微调整显微镜在固定夹中的位置。
确认成像区域质量13. 要确认待成像区域的质量，使用采集软件打开显微镜的LED灯。*典型的采集软件设置为10至20帧/秒，增益为1.0。*14. 缓慢向下推进显微镜，直至血管变得可见。注意不要让显微镜机身碰撞到GRIN镜头。位置细胞就在这层血管下方。此时背景荧光应整体明显增强。15. 如果图像清晰且轮廓分明，则撤回显微镜。
固定GRIN镜头和基板
将紫外光固化胶置于冰上以增加其粘稠度。 擦干颅骨以确保粘合剂良好附着，小心地在套管与导管之间的界面处以及套管与镜头之间的区域周围涂抹光学胶。注意不要让胶水污染镜头表面。使用18-G针头作为涂胶工具。用针头舀取胶水形成一个小球状液滴，将液滴触及套管与导管之间的空隙。然后将胶水引渗入空隙。在手术显微镜下观察胶水，持续操作直至胶层填满套管与镜头之间的空隙。 佩戴适当的护目镜，用紫外灯固化光学胶，并确认胶水已完全固化。以8°角将显微镜向下推进至镜头处，确保显微镜与镜头平行。使用采集软件观察显微镜视野。镜头外缘在所有侧面都应显得同样清晰。将显微镜向荧光信号最强的深度推进，该深度应恰好位于第一批血管变得可见的深度之下。 使用牙科丙烯酸树脂将基板粘固到颅骨上。缓慢从胶筒中挤出水泥，并做轻柔的上下移动，使水泥垂直铺展以连接基板与覆盖在颅骨上的水泥帽。沿基板周界继续此操作。小心不要让任何水泥沾到显微镜机身。为此，可以使用临时粘合剂来将镜头固定在底座上。 用LED固化灯使水泥完全固化，然后将显微镜从基板上取下。缓慢且小心地撤回显微镜。基板应保持附着在颅骨上，透过基板底部的孔应能看到GRIN镜头。 将基板盖安装到基板上，以保护下方的镜头。 将小鼠移出麻醉状态并从立体定位仪上取下。让小鼠在预热的加热垫上从麻醉中完全恢复。让所有粘合剂完全固化48小时。在此期间胶水会收缩，因此需要对显微镜的焦平面进行轻微重新调整。为此，需再次麻醉小鼠，并调整显微镜的转盘至荧光信号最强的焦平面。直接镜头植入
导管植入程序的一个替代方案是，不使用导管，直接将镜头植入目标脑区上方。这对于缺乏像外囊那样明显解剖学标志的皮层和皮层下脑区尤其有用。在直接镜头植入程序中，一个小型（直径<1毫米）的镜头被缓慢地直接推入脑中，到达目标脑区的深度。如果目标区域较深，预先抽吸一个小区域以缓解镜头植入带来的压力是有用的。一段能套在镜头顶部的小管子可以用作定制镜头固定器。直接镜头安装程序的优点是，可以省略导管植入程序中耗时的抽吸步骤。主要缺点是镜头放置的正确性较差，且只能在手术完成后才能确定。为了对背侧海马的位置细胞进行成像，使用临时粘合剂将镜头固定器暂时粘在镜头上，并放置于前-后坐标-1.9毫米，中-侧坐标1.4毫米的位置。然后，在通过显微镜实时成像观察视野的同时，将镜头降低到脑中。当深度达到约1.4至1.5毫米处可视荧光增强时，即已达到正确深度。用粘合剂固定镜头。粘合剂干燥后，将镜头从镜头固定器上释放。安装后应注意保护镜头。
诱导直线跑道奔跑的行为训练
设置直线跑道时，在周围环境中放置近端和远端的空间线索有助于通过辅助动物在跑道内的空间定向来激活位置细胞。空间线索本质上可以是视觉、触觉、味觉或嗅觉的。视觉线索可以是放置在直线跑道周围墙壁上和房间墙上的地标。触觉线索可以是对跑道的改造，例如插入地板、在地板上刻痕或使用砂纸赋予地板纹理。为了帮助小鼠区分直线跑道的两端，可以在每一端提供不同口味的液体奖励。合适的液体奖励示例包括水、加糖蔗糖水、果汁提取物或20%炼乳。使用有味道的奖励也能让小鼠意识到奖励的存在。
在直线跑道上记录位置细胞活动之前，需要对小鼠进行数日的渐进性限水，以激励它们摄取在直线跑道上提供的液体奖励。在最初几天，小鼠会探索直线跑道，并摄取少量液体奖励。随着时间的推移，穿越直线跑道的次数应稳步增加(图2A)。在直线跑道上方安装红外灯并结合近红外摄像机有助于检测跑道上的小鼠。如果不每日进行训练，可以通过继续将每日饮水量限制在1毫升来维持小鼠的表现。
图2. Thy1.GCaMP6f转基因小鼠的代表性行为和荧光信号。（A）4只小鼠在3周时间内，每次训练课的平均直线跑道奔跑次数。在前3天，消耗的奖励很少，应为小鼠补充1毫升水。表现随时间稳步提高。（B）ΔF/F荧光场的示例帧图像。（C）以10帧/秒记录的、具有钙瞬变的代表性ΔF/F荧光轨迹。（D）通过主成分和独立成分分析识别的海马锥体神经元。
材料已植入镜头的小鼠异氟烷液体奖励林格氏溶液清洁溶液电子天平小动物异氟烷麻醉系统微型显微镜直线跑道，70至100厘米视频摄像机及镜头头顶红外灯
对小鼠进行数日的渐进性限水，最终达到每日1毫升。小鼠体重应接近初始体重的80%，才能有足够动力在直线跑道上往返奔跑以获取液体奖励。在限水期间，应每日称量小鼠体重并监测其是否有痛苦迹象、行动迟缓和毛发凌乱。 用5%异氟烷短暂麻醉小鼠，直至其对脚趾和尾巴夹捏无反应。将麻醉浓度降低至2%，并根据制造商说明将微型显微镜安装到基板上。此步骤旨在让动物适应在沿跑道奔跑时附着有显微镜的情况。在此初始训练期间不会进行成像。 让小鼠从麻醉中恢复30分钟。 将小鼠置于直线跑道的中心位置，环境光照度约为60流明。 训练小鼠在直线跑道上往返奔跑15至20分钟。训练方法是，在小鼠刚摄取奖励的跑道另一端对侧，提供一份液体奖励。初始奖励体积应在10至20微升之间，目标是使小鼠在15至20分钟的训练期内消耗的奖励总量达到1毫升。如果奖励总量大于1.5毫升或小于1毫升，小鼠的奔跑次数会很少。如果小鼠在此时间内消耗的液体奖励超过1毫升，可将奖励体积最低降至7微升。可以利用例如EthoVision XT等软件和硬件辅助训练，这些工具可以监测小鼠位置，并在其到达跑道一端时自动控制分配器。 记录消耗的奖励总体积。 小心地将小鼠从直线跑道上取回。 麻醉小鼠并卸下微型显微镜。 通过皮下注射林格氏溶液补充消耗的液体奖励量，以确保每只小鼠每日至少摄入1毫升液体。 彻底清洁直线跑道。为了提供有助于空间辨别的嗅觉线索，可以使用不同的清洁剂清洁跑道的每一侧，例如水、70%乙醇或其他消毒清洁剂。钙成像与行为数据的同步记录
一旦小鼠被训练能在直线跑道上往返奔跑，就可以通过安装好的显微镜记录位置细胞活动。成像数据通过柔性系绳连续传输至运行数据采集软件的计算机。
在每次记录开始前，将显微镜安装到已固定的基板上。为了使行为数据与钙成像数据同步，可以从nVistaHD系统为每一帧采集的钙成像数据发送一个晶体管-晶体管逻辑脉冲，以触发从头顶追踪摄像机采集一帧图像。数据在小鼠于跑道上奔跑时持续记录。
材料已植入镜头的小鼠异氟烷清洁溶液生理盐水电子天平小动物异氟烷麻醉系统微型显微镜运行采集软件的计算机直线跑道，70至100厘米视频摄像机及镜头头顶红外灯
称量小鼠体重。 简要麻醉小鼠，并如行为训练方案所述，将微型显微镜安装到基板上。 启动采集软件，配置采集设置以优化钙瞬变成像。 通过旋转顶部的转盘来调整显微镜的焦距。选择一个能产生最大细胞数量、细胞轮廓清晰且胞体直径小的焦平面。一旦设定好一个良好的焦平面，在成像会话之间不要重新调整焦平面，以避免旋转伪影。设置显微镜增益和LED强度，以最大化活动依赖的神经元荧光变化，同时不诱发荧光信号饱和。为此，可观察采集软件提供的像素强度直方图。 让小鼠从麻醉中恢复30分钟。 将显微镜系绳悬挂在距离跑道至少3英尺的上方，并留有足够松弛度，使小鼠能够完全从跑道一端移动到另一端。应注意确保显微镜线缆不妨碍小鼠的行为。如果显微镜线缆在训练过程中缠绕，会缩短线缆长度，并可能影响小鼠自由移动和获取奖励的能力。 在小鼠直线跑道奔跑期间记录位置细胞，持续15至20分钟。此持续时间允许从重复的跑道穿越中记录足够量的数据，同时小鼠有足够时间在直线跑道上消耗约1毫升的液体奖励。 清洁直线跑道。 如有必要，为小鼠补充生理盐水，以确保每日至少摄入1毫升液体。 将限水维持至每日1毫升。二、评论
背景信息
位置细胞几十年前首次在啮齿类动物海马体中被发现和描述。随后，关于这些细胞的大部分知识主要来源于体内电生理技术，即将细胞外微电极植入自由行为啮齿动物的脑中。当动物探索实验控制的环境时——通常是旷场或设定的跑道或迷宫——记录这些细胞的电活动。然而，这种方法本身存在许多技术限制，包括每根电极可记录的细胞数量有限、难以识别沉默或稀疏活动的细胞，以及缺乏记录细胞精确解剖组织信息等。不过，近年来，随着能够从脑内更广泛区域采样神经元活动的大型多部位电极阵列的发展，这些限制带来的问题已有所减少。
基因编码荧光钙传感器的持续优化，最近使得神经元功能的体内成像研究成为可能。利用这种方法，可以评估海马体内数百个位置细胞的同时活动及其解剖组织。这种更大的样本量可以为研究者提供关于目标区域内细胞各种活动模式和功能特性的更好见解。最初的位置细胞成像研究是通过双光子显微镜对头部固定在小鼠上进行的，这些小鼠在可移动的跑道或跑步机上探索周围屏幕上呈现的虚拟环境。虽然这种方法的变体仍在被使用，但该装置体积庞大，加上设备成本高昂以及组装和操作所需的技术专长，使得它对大多数研究者来说相对不切实际。
最重要的是，轻型显微镜和细长柔软的系绳允许动物在其环境中基本上不受限制地活动，使得此类实验能够在更自然的环境中进行。这一点，加上相对易于使用，使其成为研究清醒、行为动物细胞功能的一个有吸引力的平台。自该技术最初发表以来，已有几种商业和开源类型的显微镜可供选择。除了海马位置细胞，微型荧光显微镜也被用于研究其他几个脑区中各种神经细胞类型的功能特性。
关键参数与故障排除
位置细胞记录的常见问题原因多围绕数据质量。海马中的细胞排列密集，必须注意尽量减少并补偿动物行为期间显微镜下脑组织的任何运动。必须将显微镜和其他组件牢固地粘附在小鼠颅骨上，以避免记录图像中的运动伪影。例如，手术区域及其周围的感染会随着时间的推移软化颅骨，损害植入体的完整性。因此，必须定期监测动物是否有感染迹象，如炎症、渗液或皮肤从水泥帽处回缩。虽然正确的手术技术有助于确保植入体稳定，但下层组织的一些运动是不可避免的。如果成像细胞的运动未得到适当校正，一个细胞的信号可能会污染其邻近细胞的信号，并降低记录质量。对来自相邻细胞的信号进行互相关分析有助于诊断这是否是一个问题。对于独立放电的细胞，这种相关性应该很低。良好的运动校正算法对于确保在一次记录会话内以及多日记录之间保持细胞身份的一致性至关重要。
整体荧光信号弱也会损害数据质量。一个可能的原因是成像导管相对于CA1锥体细胞层的位置不佳。导管底部与这些细胞之间过多的组织会由于光散射导致信号显著损失。成像实验结束后，应取出脑组织并置于10%福尔马林中24小时，以便切片验证导管位置是否正确。图3A代表性的苏木精和伊红染色切片显示了良好的导管放置位置。GCaMP报告基因的表达水平会对信号强度产生显著影响。例如，与病毒介导的表达相比，Thy1.GCaMP6f转基因小鼠中GCaMP6f的相对表达水平较低。为了补偿较低的荧光信号强度，可以降低帧率采集频率（例如，从20帧/秒降低到10帧/秒）。这将增加每成像帧收集的光子数。最后，显微镜LED导致的GCaMP6f报告基因的光漂白也会降低荧光信号强度。报告基因表达水平、LED功率以及动物连续成像的持续时间等几个因素会影响光漂白的程度。在我们的实验条件下，小鼠可以连续成像长达20分钟而不会产生显著的光漂白效应。
图3. 位置细胞记录。（A）脑组织切片的苏木精和伊红染色，显示皮层抽吸和导管植入部位。（B）单个位置细胞的活动（填充的彩色圆圈）与小鼠在直线跑道上的位置叠加显示（灰色虚线）。同一位置细胞显示了4次记录会话（第3至第6次会话）。红色填充圆圈表示位置细胞在直线跑道左侧的活动。蓝色填充圆圈表示在右侧的活动。数据以10帧/秒的速率采集。上图显示原始荧光钙信号轨迹及检测到的事件（红色空心圆圈）。（C）一只代表性Thy1.GCaMP6f转基因小鼠在9天内成像的细胞位置野活动图。细胞根据其在记录会话1（顶行）和会话9（底行）中在跑道内最大发放率的位置进行排序。
在记录高质量位置细胞数据之前，还需要通过训练和调整限水程度来优化小鼠行为。位置细胞活动对小鼠的奔跑速度和其通过位置野的次数都很敏感。海马活动随奔跑速度提高而增加，这对于位置野记录是理想的。在直线跑道上持续奔跑，没有间歇性休息期，有助于分析位置细胞。根据我们的经验，50次跑道穿越足以记录位置细胞，但位置细胞的质量会随着每次在直线跑道上的连续成像会话，以及奔跑速度和直线跑道奔跑次数的增加而改善。因此，考虑时间的影响非常重要。小鼠行为也对一天中的时间和环境噪音水平敏感。因此，记录条件应尽可能标准化。需要注意的是，限水是一种严重的应激源，可能会影响其他行为或认知指标。为确保小鼠行为达到最佳状态，应注意房间的亮度水平是否适宜。直线跑道光照过强可能导致小鼠表现出趋触性，这将妨碍奔跑行为和对位置细胞活动的分析。约60流明足以照亮直线跑道。最后，由于位置野的直径在20至30厘米之间，直线跑道的长度需要至少70厘米，以确保能够完全穿越整个位置野。
统计分析
通过微型显微镜获取的成像数据最初可以使用Mosaic软件（Inscopix）进行处理。该软件包含执行运动校正的算法，并能识别记录视野中的细胞位置，从而检测钙事件。然后，可以使用MATLAB中编写的自定义软件来分析输出，以检测位置细胞并测量位置野特性。辅助软件可用于追踪小鼠在直线跑道上的位置，该数据可与成像数据同步。或者，也可用MATLAB编写软件来检测小鼠在直线跑道上的位置。
来自多次记录会话的图像可以进行空间下采样、拼接、配准以校正运动伪影，并转换为荧光的相对变化。如Mosaic软件所提供的，可以使用主成分和独立成分分析来提取神经元及其相应的钙信号轨迹。被接受的钙信号轨迹可以进行低通滤波。然后检测神经元的钙事件的ΔF/F变化。为了识别位置细胞，可以使用EthoVision XT软件来检测小鼠在直线跑道上的位置。应丢弃小鼠跑得慢或静止的时间段。应将直线跑道划分为3至5厘米宽的区间。应丢弃直线跑道两端最外侧的两个区间，因为液体奖励的消耗行为发生在此处。识别位置细胞的一种方法是计算其事件活动中包含的空间信息。这可以有效地区分编码位置的细胞与不处理空间信息的细胞。为此，需确定小鼠在每个区间内停留的时间，并根据区间占用情况对钙事件的计数频率进行归一化。然后将最大事件率归一化为1。如相关研究所描述的，空间信息按比特/事件为单位，针对所有神经元进行计算：
空间信息 = Σᵢᵇⁱⁿˢ pᵢ (rᵢ/ṝ) log₂(rᵢ/ṝ)
其中 pᵢ 是小鼠处于区间 i 的概率，rᵢ 是该神经元在区间 i 的事件率，ṝ 是整体峰值频率。统计学显著性通过将钙瞬变的事件时间排列1000次并计算每次排列的空间信息来确定。根据排列空间信息的分布设定统计学显著性的下限。如果某个神经元的非排列空间信息超过此下限，则该神经元被定义为位置细胞。所有其他神经元被定义为非位置细胞。事件计数低的神经元应从分析中排除，因为空间信息的计算对于低事件计数存在偏差。得到的左右奔跑方向的位置细胞调谐曲线可以用高斯滤波器平滑处理，位置野位置由峰值定义。应测试位置细胞数据的正态性，并可根据所选的实验设计采用t检验或重复测量方差分析及事后检验进行分析。
预期结果
位置细胞记录应产生调谐曲线，显示当小鼠通过位置野时活动增加，而在位置野外时活动最小。位置细胞活动应类似于图3B，C中所示的活动图。施用已知会破坏空间导航、学习或记忆的药理试剂，可能会导致直线跑道奔跑行为受损，并伴随位置细胞功能障碍。例如，我们给小鼠的饮用水中添加了40微克/毫升的皮质醇，持续8周，发现皮质醇减弱了小鼠的奖励寻求行为。与未处理的小鼠相比，皮质醇处理小鼠的奔跑速度和直线跑道奔跑次数显著减少。此外，与未处理小鼠相比，皮质醇处理小鼠的位置细胞数量显著减少，同时皮质醇处理小鼠中剩余的位置细胞，其位置野的连贯性也显著低于未处理小鼠的位置细胞。
时间考量
成像实验可能耗时较长。首先，如果动物从外部供应商处运来，需要在首次手术前至少在新的饲养设施中适应1周。导管植入手术耗时约1至2小时，之后小鼠需要恢复2周。导管植入手术后进行镜头和基板安装程序，耗时1小时。此程序后，小鼠应恢复48小时，以便粘合剂有足够时间完全固化和稳定。然后需要在3天时间内对小鼠进行渐进性限水，直至达到每日1毫升的最终限制量。限水一直持续到所有行为训练和实验结束。小鼠的行为训练最多需要2周，之后可以开始成像实验。每次成像会话前，需要对小鼠进行2至3分钟的短暂麻醉以安装显微镜。小鼠应从麻醉中恢复30分钟再开始成像实验。单次成像会话持续15至20分钟。记录天数取决于实验设计和待验证的假设。在我们的实验中，我们记录了9天的位置细胞活动。完成本方案描述的所有程序所需的总时间约为6至8周。
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